烟草中有机酸分析研究进展

 有机酸是烟草中的重要组成部分。烟草中的有机酸主要是指除氨基酸以外的有机酸,其种类繁多,含量差异大,总含量一般为12%~16%,且大部分以与碱金属或有机碱化合成盐或以酯类的形式存在。有机酸不仅在烟草生长过程中起着重要的作用,而且对烟叶和卷烟的质量有着重要的影响,尤其是挥发性有机酸,尽管其含量很低,最多达0.1%~0.2%,有的甚至只有0.01%~0.05%,但其对烟叶感官质量的影响却远远大于多元酸和高级脂肪酸。因此,烟草中有机酸的分析研究一直受到国内外烟草工作者的高度重视。   1.烟草中有机酸的分析   国外对烟草中的有机酸研究较早,20世纪初就有关于烟草中草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸和酒石酸的报道。1955年,FrankE.Resnik等采用纸层析法定性分析了晒烟中的有机酸,共测定了苹果酸、琥珀酸、酒石酸和柠檬酸等12种有机酸;同时,还采用柱层析法分析了反丁二烯酸、琥珀酸、草酸、苹果酸和柠檬酸。1957年,Donald A. Buyske等采用柱层析技术分离并定量分析了烤烟、白肋烟、香料烟烟气中的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和苯甲酸等13种酸。1962年,Swain A. P. 和Stedman R. L.等采用正己烷萃取、甲酯化和气相色谱法定量分析了晒烟中的肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。随后,Schmeltz I.等采用气相色谱法测定了2个等级的烤烟和香料烟中14种C1~C8有机酸。 Stedman R. L.等通过对不同品种烟草中17种C1~C9挥发酸的分析发现,香料烟含有比烤烟高得多的3?甲基戊酸、戊酸和异戊酸,而甲酸和乙酸则相对较低。相比之下,白肋烟和马里兰烟中所有有机酸的含量都较香料烟和烤烟的低。1968年,Jones T. C. 和Schmeltz I.先用Tri-Sil试剂对烟草中有机酸进行硅烷基化处理,再采用气相色谱法分析了甲酸、乙酸、异丁酸、异戊酸和3-甲基戊酸等近40种有机酸。1972年,Demole E. 等采用水蒸气蒸馏、氯仿萃取和真空蒸馏法先将白肋烟精油分为高、中、低3个沸程馏份,再分别进行10%Na2C03溶液处理、CH2N2酯化和GC分析,在35~80℃中沸程馏份酸性部分中鉴定出甲酸、乙酸、丙酸和异丁酸等19种有机酸;在84~114℃(1.33Pa)高沸程酸性部分中鉴定出22种酸性成分,包括山梨酸、苯甲酸、苯乙酸、α-苯基巴豆酸、2-壬烯酸和香豆酸等。同年,Roberts D. L. 和Rohde W. A.采用氯仿萃取、酸碱中分离和GC/MS法从白肋烟中鉴定出2-甲基丁酸、戊酸、3-甲基戊酸、己酸等12种酸性成分。次年,Kimland B. 和Aasen A.J.等采用水蒸气蒸馏、乙醚萃取、碱洗和酸化的方法对希腊晒烟进行处理,得到的酸性成分经碳酸氢盐水溶液洗涤分成强酸(有机酸)和弱酸(酚类)部分。强酸部分一分为二,一部分用重氮甲烷甲酯化,另一部分在硫酸催化下用甲醇甲酯化(5h)。GC分析显示,2种不同的甲酯化步骤得到大致相同的产物,所不同的是,5个碳以下的酸在回流状态下的甲醇酯化过程中部分流失;2-乙基-3-甲基马来酸用重氮甲烷酯化得到的是其相应的酐,而甲醇酯化得到的是二甲酯。通过GC/MS检测,鉴定出近百种有机酸成分,包括33种饱和酸(没有检出甲酸、乙酸)、21种单烯酸、7种二烯酸、3种三烯酸、8种芳香酸和8种氧化脂肪酸。1974年,Schumacher J.N.和Vestal L. 等采用2种不同的前处理方法??正己烷直接萃取和水蒸气蒸馏后再用正己烷萃取对香料烟进行处理。前者萃取的酸性部分鉴定出异丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸和3-甲基戊酸等13种成分,后者萃取的酸性部分鉴定出异戊酸、3-甲基戊酸、己酸和庚酸等13种成分。1976年,Lloyd R. A.等同时采用溶剂萃取和水蒸气蒸馏2种不同的分离路线,再用稀碱溶液处理分离出酸性成分,而后甲醇酯化和GC/MS分析,共鉴定出48种酸性成分,包括C2~C12的脂肪酸、苯甲酸、巴豆酸、香叶酸、花生酸、棕榈酸、水杨酸、香草酸、茴香酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、丙酮酸等。1977年,Inger Wahlberg等采用顶空吸附、乙醚萃取、酸碱中分离、重氮甲烷甲酯化(0℃)、GLC和GC/MS法对烘烤和陈化过程中烤烟酸性成分的变化进行了分析,共鉴定出86种酸性成分,发现大部分挥发酸均随烘烤及陈化过程而增加,一般在陈化第6个月达到最大值。同年,Chuman T. 和Noguchi M. 采用异丙醚萃取、重氮甲烷甲酯化和GC/MS法对香料烟中的酸性成分进行了分析,共鉴定出93种酸性成分:26种饱和脂肪酸、24种不饱和脂肪酸、10种二元脂肪酸、12种芳香酸、16种萜烯酸及5种其它酸。1989年,William A. 和John G. Hendel等采用硫酸-甲醇甲酯化和GC法分析了生长期间烟草中的草酸、丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸等6种非挥发性有机酸,发现苹果酸是烟草生长的各个阶段的主要有机酸。1997年,Jeffrey T. Clark和John E.Bunch等采用固相微萃取、重氮甲烷甲酯化和GC法分析了烟草中包括乙酸、异戊酸、戊酸、3-甲基戊酸、苯甲酸和苹果酸等40种有机酸。  在国内,1958年张泳泉曾采用水蒸气蒸馏和碱滴定的方法测定了烤烟中的总挥发酸。1985年,李云采用索氏萃取器萃取、碱洗酸化、水蒸气蒸馏和HPLC法首次测定了国产烤烟和香料烟中Cl~C9的低级脂肪酸。结果显示,甲酸、乙酸、辛酸、壬酸的回收率较低,癸酸则完全没有检出。原因是这几个低分子量酸的水溶性和挥发性太强,而癸酸是挥发性太弱,有机溶剂很难进行有效萃取。同时与国外烤烟进行了对比,并结合评吸,认为一些低级脂肪酸含量低是我国烟叶质量较差的一个原因。1988年,郭亚东采用重氮甲烷甲酯化和GC法分析了云南烤烟和晾晒烟中的51种有机酸,其中包括26种一元脂肪酸。该法对分子量大、难挥发的酸性成分分析效果较好,而对于分子量小的挥发酸如乙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、3-甲基戊酸等的分析则不理想。随后,李云等又采用三甲基硅烷化酯化技术结合毛细管GC法对11种国产烤烟、香料烟和白肋烟中的12种低级脂肪酸进行了分析。发现各种烟草中的低级脂肪酸组成相似,但含量有差别,如烤烟中甲酸和乙酸的含量比香料烟和白肋烟的高;香料烟中的异丁酸、异戊酸和3-甲基戊酸比烤烟和白肋烟的高得多;质量好的烤烟和香料烟中的总挥发酸比质量差的烟叶高,尤其是其异/正构酸的比例比质量差的烟叶大。1998年,李炎强和冼可法采用同时蒸馏萃取、碱洗、酸化和HP-20M毛细管柱直接进样GC/MS法鉴定了烟草中19种挥发性和半挥发性酸性成分,并进行了定量分析。重复性和回收率试验显示,该方法适于分析不少于6个碳原子的挥发性、半挥发性酸成分,其中包括3-甲基戊酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等重要酸性香味成分的测定。与甲酯化法相比,该方法简化了分析步骤,而且对于C9以上脂肪酸的分析有较高的回收率,但C5以下低级脂肪酸的回收率则很低。1999年,李炎强等采用同时蒸馏萃取和GC/MS法对云南、河南烤烟烟叶中游离态和结合态的挥发性及半挥发性脂肪酸进行了分析,共定量测定了21种酸性成分。结果显示,分子量较小、挥发性较强的脂肪酸,如异戊酸、戊酸、3-甲基戊酸,以结合态形式存在的较多;而分子量较大的半挥发性脂肪酸,游离态多于结合态。从所分析的21种酸性成分看,云南烤烟中游离态酸以及游离态和结合态酸的总量都比河南烤烟的高。同年,刘百战采用样品直接甲酯化(甲酯化试剂为硫酸-甲醇)和GC法对云南烤烟中高级脂肪酸和多元酸进行了分析。结果表明,中部烟叶的高级脂肪酸含量最丰富,下部烟略少,上部烟最少。此外还发现,桔黄色烟叶中非挥发性有机酸的平均含量最高,其次依次为杂色、红棕,柠檬黄烟叶最低。2000年,陈章玉等采用甲酯化后固相微萃取顶空吸附和GC技术对3个不同品种的烤烟烟叶中的有机酸进行分析,共鉴定出了40多种挥发及半挥发性有机酸,但仅对3-甲基丁酸、苯乙酸、辛酸、十四酸和十六酸进行了定量分析。   2.烟草中有机酸分析方法比较   早期的烟草组成成分的分析主要采用化学方法,由于很多成分含量很低,分离、纯化、鉴定都十分困难,能分析检测的成分种类很少,很难全面深入研究。自从1952年James和Martin提出GC法以来,特别是1955年Golay M. J. E.提出毛细管柱GC法,以及HPLC、MS、IR、NMR、GC/MS和GC/IR等技术的相继开发与应用,使复杂的烟草组分分析步入了全新的时代。烟草中有机酸的分析一般是先对烟草样品进行适当的前处理,再用GC、GC/MS或HPLC进行检测。前处理主要是指用有机溶剂或水等对烟草样品进行萃取和碱洗、酸化,以及进行或不进行适当的衍生化处理。直接进样法是将所得到的酸部分直接注入仪器中进行分析。该法虽然简化了前处理,但一般较难取得理想的效果,这是因为一些低分子量的脂肪酸如甲酸、乙酸和丙酸等的水溶性和挥发性都很强,回收率很低、重复性差,仪器的响应值较低,且严重污染色谱柱。也有实验表明,同时蒸馏萃取/GC/MS直接进样法对分析C6以上挥发、半挥发酸重复性较好、回收率较高,分析效果好。衍生化法主要包括甲酯化、氯甲基化、丁酯化、硅烷基化、苄基化等。该法有效降低了分析物的沸点、提高了仪器响应值,避免了柱子污染。但该法主要适用于非挥发酸,对于水溶性强、挥发性强的低于C5小分子脂肪族酸如甲酸~异戊酸等的效果不佳,回收率低、重复性差,且分析时间较长。对于多元酸和高级脂肪酸,衍生化法取得了较好的效果。烟草挥发性有机酸的前处理一般是先水蒸气蒸馏,然后有机溶剂萃取,或先有机溶剂萃取再水蒸气蒸馏。在定性、定量分析技术方面,早期采用的是纸层析和柱层析等技术,现在应用较多的是GC、IR、GC/MS等检测技术,近年来,应用HPLC、毛细管电泳和离子色谱等方法进行分析也屡见报道。HPLC法主要适用于烟草中多元酸和高级脂肪酸,也可用于烟气中有机酸的分析。如1994年Lagoutte D. 和Lombard G. 等应用反相HPLC及毛细管电泳对卷烟烟气中含量较高的4种低分子酸:甲酸、乙酸、乳酸和羟基乙酸等进行了对比分析。结果发现:相对于老的检测技术如GC与离子交换HPLC,反相HPLC与毛细管电泳不需要对样品进行复杂的萃取及纯化处理,从而大大降低了样品损失。此外,与反相HPLC相比,毛细管电泳的优点是①简便。仅需对样品进行稀释,而反相HPLC需要复杂的衍生化处理;②耗时短,仅需十几分钟,而反相HPLC需要相对较长的时间(另外衍生化还需数小时);③低损耗、所需溶剂少;④不需要接触有毒溶剂。   总之,至今烟草有机酸的分析技术己有了很大进展,但是由于烟草中有机酸的种类繁多,不同种类有机酸含量及其性质差异很大,如有的酸含量高达几十毫克/g烟叶,有的酸含量不到1μg/g;有些酸水溶性很强,有些仅溶于有机溶剂;有些挥发性很强,而有些挥发性很弱,甚至不挥发,因此在分析烟叶中各种不同性质的有机酸时,目前常用的方法往往存在一定的局限性,需要采用多种分离与分离步骤。因此,改进现有方法,开发新的方法,使烟草中有机酸的分析过程更简便、快速,分析结果更准确,是今后烟草有机酸分析研究的重要课题。

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